분석항목 FAQ

MACSima 분석은 단순 이미지 획득이 아니라, 이미지 → 단일세포 데이터 → 생물학적 해석으로 이어지는 통합 분석 파이프라인(Image acquisition → Cell segmentation → Feature extraction → Cell classification → Spatial analysis → Statistics)으로 구성됩니다.
① Image Processing & Preprocessing과정
   Multi-cycle 이미지 정렬 (image registration), background correction, signal normalization을 수행하며, 반복 염색 과정에서 발생하는 이미지 shift 보정과 marker 간 정량 비교 가능 상태 확보를 목적으로    진행합니다.
② Cell Segmentation과정에서는 nucleus 기반 segmentation (DAPI)을 진행하며, marker 기반 cytoplasm detection을 통해 조직 이미지를 개별 세포 단위 객체로 분리합니다.
③ Feature Extraction과정으로 넘어가게 되면, 각 세포에서 marker intensity (mean / median / integrated)와 cell size / morphology, 위치 좌표 (x, y)를 획득하게 되며 이를 통해, 각 세포를 하나의 데이터 포인트로 인식하며, tissue flow cytometry + spatial 정보 결합 형태의 분석이 가능해집니다.
④ Cell Phenotyping에서는 Workflow editor (rule-based gating)을 통해 CD3+, CD8+ → cytotoxic T cell 또는 CK+, E-cadherin+ → epithelial cell과 같은 분류가 가능하며, data-driven clustering 기능을 이용하여 UMAP / t-SNE / k-means / graph-based clustering과 같은 분석이 가능합니다.
⑤ 특정 세포 주변 구성 분석을 위한 cell–cell 거리 계산, neighborhood analysis가 가능하며 면역세포가 tumor 내부로 얼마나 들어왔는지를 확인하기 위한 infiltration analysis가 가능합니다.  또는 marker 조합을 통해 functional state analysis가 가능하며, 의뢰자가 희망하는 분석방향에 맞춰 상위 기술된 다양한 접근 방법과 예시를 선택적으로 적용하게 됩니다.
 
MACSima는 조직 기반 고정 샘플부터 세포 기반 샘플까지 다양한 유형을 분석할 수 있는 spatial proteomics 플랫폼입니다. 다만, 조직의 상태와 처리 방법이 결과의 정확도를 크게 좌우하므로 아래 조건을 반드시 고려해야 합니다.
① FFPE Tissue (가장 권장) -> Formalin-Fixed Paraffin-Embedded
② 조직두께: 3–5 μm fixation -> 과도한 fixation (over-fixation) 지양
③ Block 상태는 crack이나 necrosis없을 것. 오래된 블록(≥5–10년)은 antigenicity 감소 가능 일부 marker는 retrieval 조건에 민감 Frozen Tissue -> OCT embedding 후 cryosection 항원 보존 우수 (특히 phosphorylation marker) 민감한 단백질 분석에 유리조직 morphology 상대적으로 불안정 section quality variability 큼 cryosection: 5–10 μm 빠른 freezing (liquid nitrogen/isopentane) Cultured Cells Chamber slide Cytospin preparation 균일한 조건 → 해석 용이 marker validation 및 pilot study에 적합spatial context 제한적 cell density 너무 높으면 segmentation 어려움method validation / antibody panel 최적화에 매우 유용 Tissue Microarray (TMA) 여러 환자 샘플을 하나의 slide에 배열 high-throughput 비교 분석 가능 cohort study에 매우 효율적core size 작음 → heterogeneity 반영 제한 MACSima에서 결과를 좌우하는 가장 중요한 요소: 3가지
Fixation quality Section quality Antigen preservation 장비보다 샘플이 더 중요합니다FFPE block 상태 확인 후 절편 제작 권장 (슬라이드 보관 최소화) unstained slide는 가능하면 1–2주 내 사용 pilot staining으로 marker signal 확인 필수 연구 목적에 따라 샘플 타입 전략적으로 선택
MACSima는 다중 항체를 순차적으로 반복 염색/이미징하여 수십~수백 개의 단백질을 단일 조직에서 분석하는 spatial proteomics 플랫폼입니다. 기존 면역형광염색(IF/IHC)은 보통 한 번에 제한된 수의 마커(3~7개)만 확인할 수 있지만, MACSima는 항체 염색–이미징–신호 제거–재염색 과정을 반복하여 한 장의 조직 절편에서 수십~수백 개의 단백질의 발현과 위치 정보를 순차적으로 획득합니다. 즉, MACSima는 단순히 “예쁜 형광 이미지”를 얻는 장비가 아니라, 조직 내 세포들이 어떤 종류인지, 어떤 기능 상태인지, 서로 어디에 위치하고, 얼마나 가까이 존재하는지, 어떻게 상호작용하는지를 정량적으로 분석하는 spatial biology 플랫폼입니다.
MACSima는 cyclic staining–imaging–signal erasure를 반복하여 하나의 샘플에서 많은 markers를 분석하는 플랫폼입니다. 따라서 문제는 대개 장비 자체보다 sample condition (조직 박절 상태, 주름, 찢김, 이탈, 변질), 조직 특성, 항체 특이도, autofluorescence, segmentation (조직 섹션 두께)에서 발생하는 경우가 많습니다. MACSima의 MICS 기술은 단일 샘플에서 수십~수백 마커를 반복 분석할 수 있지만, FFPE, FF, cell culture sample 각각에 맞는 준비가 필요합니다.
 
문제 원인 권고사항
Autofluorescence FFPE, RBC, collagen, lipofuscin, lipid, elastin Pre-bleaching 과정
Tissue detachment 슬라이드 접착 불량, 조직 이탈 반드시 코팅 슬라이드 사용
Poor segmentation 핵 밀도 높음, 지방 공포, 섬유화, 괴사 3~4 µm section
Weak signal 오래된 block, 과고정, 항체 부적합 항체 validation
Non-specific staining 항체 cross-reactivity, blocking 부족 고정방법(FFPE or FF), antigen retrieval, 종간 cross reactivity확인
Cycle-to-cycle shift 반복 imaging 중 위치 drift DAPI re-staining every 4-8 cycle
Bleed-through / residual signal 신호 제거 불완전으로 인한 다음 cycle marker 오염 Miltenyi validated 항체 사용 권고, 3rd party 항체 사용시 FITC, PE, APC conjugation 권고
Panel design failure marker 수 과다, marker priority 불명확 Cyclic staining 실험 디자인 단계에서 marker 중요도에 따라 cycle 순서 배치(secreted protein, rare targets, indirect labeling
-> membrane, intracellular protein, dominant, direct labeling)

종별 문제: Mouse / Rabbit / Human
Mouse 조직은 전임상 모델에서 많이 쓰지만, MACSima에서는 다음 문제가 흔합니다.
-> 조직 크기가 작고 fragile
-> Spleen, lymph node, lung처럼 세포 밀도 높은 조직에서 segmentation 문제
-> Mouse Fc receptor에 의한 비특이 결합
-> Mouse-on-mouse antibody 사용 시 background 증가
-> 혈액 잔류 시(perfusion 미시행) RBC autofluorescence 증가

주의할 조직
-> Mouse lung: alveolar 구조 때문에 빈 공간이 많고 tissue tearing 가능
-> Mouse adipose: 지방세포가 크고 prep과정 중 녹아버림. segmentation 어려움
-> Mouse brain: lipofuscin/autofluorescence, myelin background
-> Mouse bone/bone marrow: decalcification 영향 큼
 
분석 비용은 실험 종류, slide 개수, imaging 조건, 사용 항체 등에 따라 달라집니다. 실험 상담과정을 거쳐 의뢰서 접수 후 견적을 안내해드립니다.